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吉林快三最大遗漏no:突變型PUMA質粒的構建及表達_圖文

吉林快三走势图表跨度 www.dkkczn.com.cn 安徽 醫科 大學學報

A c t a   U n i v e r s i t a t i s   Me d i c i n a l i s   A n h u i ?。?0 1 3   A p r ; 4 8 ( 4 )  

?3 4 1?  

突變型 P U MA質粒 的構建及表達 
黃 偉  , 萬 福生 
摘要  目的  構 建促 凋亡 基 因 p 5 3上調 凋 亡調 制 物 ( P u —  

力 。由于 P U MA 的內源 性表 達 水 平低  、 編碼 區富 
含 G C等 原 因 , 獲取 P U MA 目的基 因 困難 重 重 。該 

M A) 的真核表達載體 和針對其 磷酸化位 點定 點突變 的真核 
表達載體 , 為進一步研究其 功能奠定基 礎。方法 通過 P C R   方法從 p C E P 4 . ( H A) : 一 P U MA質粒 中擴增 P U MA基 因, 并克 

研 究使 用 的 P U MA基 因來 源 于 p C E P 4 一 ( H A)   - P u -   MA質粒 , 通 過野 生型 和 突變 型 質粒 的成 功 構 建 , 旨  在 為 突變 型 P U MA對 腫 瘤 細胞 的促 凋 亡 功 能 研 究 
奠定基 礎 。  

隆到 p I R E S 2 . E G F P載 體 上 , 構建 P U M A 真 核 表 達 載 體 
p I R E S 2 一 E G F P 一 ( HA)   . P U M A, 利 用 定 點 突 變 技 術 構 建  p l R E S 2 一 E G F P 一 ( H A) , 一 P U M A— T 2 8 G, 行 P C R及 測 序 鑒 定 ; 脂  質體分別 將兩種 質粒轉 染 He l a細胞 , 同 時設 未轉染 的 陰性  對照組及轉染 空 載體 組 ( 4個 實 驗組 ) ; P I 染 色觀 察 P U M A   對細胞的促凋亡作 用 ; 流式 細胞儀檢測細胞 凋亡率 ; R T — P C R   檢測 P U MA的表達 ; We s t e r n   b l o t 檢測 突變 型 P U MA蛋 白和  標簽蛋 白的表達 。結果 經P C R及 測序 結果 表 明 , 正確 構  建野生型 、 突變 型 P U MA重組 質粒 , P U MA基 因第 1 0位氨基  酸的第 2 8~3 0位 堿 基 由絲 氨 酸 ( T C C) 突 變 為 丙 氨 酸 

1 材 料與 方法 
1 . 1 材 料 

1 . 1 . 1   質 粒、 細 胞 株  含 P U M A .   全 長 基 因 的 

p C E P 4 . ( H A) 2 一 P U M A質 粒 由美 國約 翰 ?霍 普 金 斯  大學 醫學 院腫 瘤學 中 心余 健 教 授 構 建 及 饋贈 ; H e l a   細胞 由本教 研室 保存 。  
1 . 1 . 2 主要 試 劑 p I R E S 2 一 E G F P載體 、 p l a t i n u m   p f x  

( G C C) , 其 他堿基 均無 突變 ; 野生 型 、 突變 型 P U M A重 組 質 
粒轉染 H e l a 細胞熒光顯微鏡觀 察到綠 色熒 光 , 而P I 染色 觀  察到野生型 、 突變型 P U M A對 H e l a細胞的促凋亡作 用 ; 流 式  細胞術檢測結果顯示突 變型和野 生型 P U MA轉染組 凋亡 率  高于 陰性對照組和空載體轉染組 ; We s t e r n   b l o t 和R T — P C R檢  測出 E 1 的基 因的高表 達。結論
譯后調節奠定基礎 。  

聚合酶 、 質粒提取試劑 盒、 L i p o f e c t a m i n   2 0 0 0、 T R I z o l  
試 劑均 購 自上海 I n v i t r o g e n公 司 ; 限 制性 內切酶 X h o   I 和E c o R   I 購 自美 國 MB I 公司; T 4   D N A連接 酶購  自美 國 N E B公 司 ; D N A 純化 試 劑 盒 購 自美 國 A x y —   g e n公 司 ; 定 點 突變試 劑盒 、 Ma r k e r   1 5   0 0 0 、 Ma r k e r  

成 功構建 了 P U M A基 因及 

其定點突變載體 , 為深入 研究 P U MA基 因的抑癌 功能及其 翻  關鍵詞 p 5 3上 調凋 亡調制 物 ; p I R E S 2 一 E G F P ; 定點 突變 ; 真 
R   7 3 7 . 3 3 ; R   3 2 9 . 2 ; R   3 9 4 . 2  

7 0 0購 自 日本 T a K a R a公 司 ; 1 6 4 0培 養 基 及 胎 牛 血  清購 自美 國 Hy c l o n e公 司 ; P U MA — C末 端 抗 體 購 自  
美國C S T公 司 ; P I 染 料 購 自美 國 S i g m a公 司 ; 感 受  態細胞 D H 5 e  ̄ 、 逆 轉 錄 試 劑 盒 購 自北 京 全 式 金 生 物  技術有 限公 司 。  
1 . 2 方法 

核表達載體 
中圖 分 類 號 文獻標志碼 A 文章編 號 1 0 0 0—1 4 9 2 ( 2 0 1 3 ) 0 4— 0 3 4 1 —0 5  

p 5 3上 調凋 亡調 制物 ( p 5 3   u p r e g u l a t e d   m o d u l a t o r   o f   a p o p t o s i s , P U M A) 是 一 個 具 有 強 大 促 凋 亡 能 力 的 

1 . 2 . 1   目的基 因的 擴增

① P C R 引 物 的設 計 : 根 

B H 3 一 o n l y家族蛋 白質 基 因 , 其 轉 錄體 P U MA - O t 編 碼 


據 目的序 列 設 計 合 成 P C R引物 , 該 引物 分 別 在 上 、  
下游 引物 中引入 X h o ?。?和E c o R   I限制性 內切酶 位  點, 擴增 p C E P 4 一 ( H A)   一 P U MA質粒 中的 P U MA基 因 

個 全長 為 1 9 3個氨 基酸 的蛋 白。最近研 究  證實 

P U M A 一  蛋 白 1 0號 位氨 基 酸 ( 絲氨酸) 為 重 要 的磷  酸化 位點 , 當改 變 1 0號 位 磷 酸 化 位 點 后 可 以減 慢 

序列 及 H A標 簽 。采 用 P r i m e r   5 . 0軟 件 序 列 如 下 :  
( H A)   一 P U M A 正 向引物: 5   一 A T C A T C C T C G A GG C -  
CACCATGGGAT ACGATGTTCCAGATY ACGCTI " CG一 3  

P U M A的降解、 延長其 半衰期 、 增強其促 凋亡 的能 
2 0 1 2—1 0—2 2接 收 

( 下劃 線 標 記 的部 分 為 酶 切 位 點 X h o ?。桑?, 反 向引 
物: 5   - A T C A T C G A A T T C C T A A T T G G G C T C C A T C T C G G  

基金項 目: 江西省 自然科 學基金 ( 編號 : 2 0 1 0 J Z Y 0 2 3 7 )   作者單 位 : 南昌大學 生物化學 與分子生 物學教研 室 、  實驗動物 科  學部 , 南昌 3 3 0 0 0 6  

G G G C T C T G T G - 3   ( 下 劃 線 標 記 的 部 分 為 酶 切 位 點 

作者簡介 : 黃 偉, 男, 碩士研究生 ;  
萬福生 , 男, 教授 , 博士 生導師 , 責任 作者 , E . ma i l : w a n f s 0 1  
@】 6 3 . c o m 

E c o R   I ) 。② 目的基因的擴增 : 以p C E P 4 . ( H A)   一   P U M A質粒為模板 , 用上述合成 的引物擴增( H A) : .   P U M A片段 , 產物 大小 約 6 5 0   b p 。P C R反應條件 :  

?

3 4 2。  

安徽 醫科大學學報

A c t a   U n i v e r s i t a t i s   Me d i c i n a l i s   A n h u i ?。?0 1 3   A p r ; 4 8 ( 4 )  

9 5 ℃預 變性 3   a r i n , 9 4 ℃變性 3 0   S , 5 8 c C退 火 3 0   S ,  

a r i n后離 心 , P B S緩 沖液洗 滌 細胞 2次 , 緩 沖液重 懸 

6 8  ̄ C 延伸 9 0   S , 3 0個 循環 , 6 8 ℃延伸 1 0   m i n 。經瓊脂  糖 凝膠 電泳 鑒定 , 并 使用 凝 膠 純 化試 劑 盒 回收 目的 
片段 。   1 . 2 . 2 ?。?I R E S 2 - E G F P 一 ( H A) , - P U MA 重 組 質粒 的 構 

細胞 , P I 染色 , 流式 細胞儀 測試分 析 。  
1 . 2 . 6 ?。?T . P C R檢 測 細胞 P U M A   m R N A表達 按 

照T R I z o l 試 劑說 明 書提 取 2 4 、 4 8   h總 R N A, 紫 外 分 
光光 度法 和瓊脂 糖凝 膠 電泳檢 i 貝 4 其 純 度 和濃 度 , 按 



P C R擴 增 產 物 與 空 質 粒 p I R E S 2 . E G F P用 X h o  

照逆 轉 錄試 劑 盒說 明 書操 作 合 成 c D N A, 進行 P C R   擴增 。引 物 序 列 及 擴 增 條 件 見 表 1 。擴 增 產 物 經  1 . 5 % 瓊脂糖 凝膠 電泳檢 測 。  
表1 ?。?T? P C R 引物 序 列及 擴增 條 件 

I 和 E c o R ?。傷?酶切 , 3 7  ̄ C酶 切 1   h后 電泳 切膠 回  收、 純化 , T 4   D N A連 接酶 連 接 , 轉 化感 受 態 細胞 , 挑 

取 陽性 菌 落 接 種 于 含 卡 那 霉 素 的 液 體 L B培 養 基  中, 3 7  ̄ C震蕩 過夜 , 菌落 P C R鑒定 , 正 確 后送 交 上?!?br />英 駿 生物技 術公 司測 序并進 行 B L A S T比對 。  
1 . 2 . 3 突 變型 P U MA質 粒 的構 建及 鑒 定 ① P C R  

引物 的設 計 : 根 據 目的基 因 和 突變 位 點 序列 信 息設  計一 對擴 增 引物 , 序列 如 下 : P U MA . ?。?o r u t . F : 5   一 G C —  
CCCGGAGCCCGTAGAGGGCCT GGCCCG一 3  , PUMA一   僅. nu t - R: 5   一 GCTGCCCTCCTGGCGTGCGCGCCCCAT—  

C A . 3 ?。?下劃 線標記 的堿 基為 突變 點位 , 由 T突變 成 

G) 。② 擴增 點 突變 序列 : 以p I R E S 2 一 E G F P . ( H A)   .  
P U M A質 粒 為模 板 , 擴增點 突變序列 , 產 物 大 小 約  6   0 0 0   b p 。 P C R反應 條件 : 9 4 ℃3 0   S , 5 5   o C   3 0   S , 7 2 o 【 =  

1 . 2 . 7   We s t e r n   b l o t 檢測 H e l a細 胞 突 變 型 P U MA  

蛋 白表 達

轉 染后 H e l a細胞 置 于 3 7 o C、 5 % C O ,培 

養箱 中孵 育 2 4 、 4 8   h , 提 取蛋 白裂解 液 , 測 定 蛋 白濃  度, We s t e r n   b l o t 驗 證 突變 型 P U MA質粒 在 細胞 中的 
表達 。  

6   m i n , 3 0個 循環 ; 1 6  ̄ C無 限循 環 保 存 。③ 用 1 % 瓊 
脂糖 凝膠 電泳 P C R產物 , 切膠 回收 目的 D N A片 段 。  

對P C R產物 進 行 末 端 平 滑 及 5   磷酸 ( P) 化處 理。   ?。??。?磷 酸 化 處 理后 的反 應 液 于 新 的 微 量離 心 管  中, 再 加入 5 ?。?  L i g a t i o n   S o l u t i o n   I , 均勻混 合 , 1 6  ̄ C 反  應 1   h進 行 自身 連 接 反應 。取 5 ?。?連 接產 物 加 到 

1 . 3 統計 學 處理

采用 S P S S   1 1 . 5統 計 軟件 分析 ,  

數 據均 用  ± S 表示 , 多組 間 比較 采用 單 因素方 差 分 
析, 四組 問 比較采用 L S D法 。  
2 結 果 

5 0 ?。?  D H 5 o L 感受態細胞里轉化 。挑取 陽性菌落接 
種 于含 卡 那 霉 素 的液 體 L B培 養 基 中 , 3 7 c C震 蕩 過  夜, 菌落 P C R 鑒 定 后 測 序 驗 證 目的 片 段 的 突 變 序 
列。  

2 . 1   目的基 因 P UMA擴增產 物 的鑒定

P C R產 物 

經 瓊脂 糖凝 膠 電泳 鑒定 , 結 果見 圖 1 。 目的基 因 片  段 的理論 大小約 6 5 0   b p , 電泳條 帶單 一 , 大小與 預期 
基本 一致 。  
b p  
M  1  

1 . 2 . 4 野 生型 、 突 變型 P U MA質 粒 在 H e l a細胞 中   的轉 染及 P I 染 色 ① 用質 粒 抽 提試 劑盒 對 經 鑒定  構建成 功 的野 生 型 和 突 變 型 P U MA 進 行 抽 提 。取 

對 數生 長期 H e l a細胞 , 按照 L i p o f e c t a m i n e   2 0 0 0說 明  書, 分別 用上 述 兩質 粒 轉 染 細胞 及 空 載體 質粒 。②  移去 1 6 4 0培 養基 , 用P B S清洗 1次 , 加入 P I 染色 液 

2   0 0 0   1   0 0 0  
9 0 0   8 0 0   7 0 0   6 0 0   5 0 0  

6 5 0  

室溫作用 1 5   m i n以上 , 注意避光 , 無菌操作 , P B S在 
室溫 漂洗 3次 , 熒 光顯微 鏡 觀察細 胞核形 態 學改 變 ,   照相保 存 實驗結 果 。  
1 . 2. 5   An n e x i nV— F I T C / P I雙 標 記 法 檢 測 細 胞 凋 亡 

圖 1 擴 增 的 目 的基 因片 段 電 泳 圖  M: D N A   Ma r k e r   1 5   0 0 0 ; 1 : P U MA   P C R產 物 電泳 條 帶 

2 . 2 ?。?l R E S 2 - E GF P - ( H A) 2 - P UMA- T 2 8 G 突變 序  列擴增 結果  以 p I R E S 2 一 E G F P 一 ( HA) 2 一 P U MA質?!?br />
收集 轉 染后 2 4   h細胞 , 進行 A n n e x i n V檢 測 。將  細胞懸 浮 于結 合 緩 沖液 中 , 調整濃度為 2 . 5   X   1 0   /   m l, 與 F I T C標 記 的 A n n e x i n   V混 合 , 室 溫孵育 l 0  

為模 板 , 用 P U M A. 僅 . o r u t . F和 P U MA - 儀 - ou r t - R兩 條 

引物擴 增序列 , 序 列長度 約 6   0 0 0   b p , 見圖 2 。  

…  
安徽 醫科大 學學報 A c t a   U n i v e r s i t a t i s   Me d i c i n a l i s   A n h u i ?。?0 1 3   A p r ; 4 8 ( 4 )   ? 3 4 5?  

粒, 為后 續 研 究 突 變 型 P U MA 對 腫 瘤 細 胞 增 殖 、 凋 
亡 的影 響及其 機 制 的探 究 , 和 將 來 尋 找更 多 P U MA  

i n d u c e d   b y   p 5 3 [ J ] .Mo l   C e l l , 2 0 0 1 , 7 ( 3 ) : 6 8 3— 9 4 .  
S a n d o w  J   J, J a b b o u r   A  M, Co n d i n a   M  R, e t   a 1 .Cy t o k i n e   r e c e p t o r  
s i g na l i n g   a c t i v a t e s   a n   I KK— d e p e n d e n t   p h o s p h o r y l a t i o n   o f   PUMA   t o  

蛋 白翻譯后信號通路調控機制奠定了實驗基礎 。   參考文獻 
F r i c k e r   M, P r e y   O  J , T o l k o v s k y   A   M, e t   1.Ph a o s p h o r y l a t i o n   o f   p u -  
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Mo u n t f o r d   P   S, S mi t h   A   G.I n t e r n a l   ib r o s o me   e n t r y   s i t e s   a n d   d i c i s ?  

t r o n i e   R NA s   i n   ma mm li a a n   t r a n s g e n e s i s [ J ] . T r e n d s   G e n e t , 1 9 9 5,  
1 1 ( 5 ) : 1 7 9— 8 4 .  
J a n g   S   K, Kr a u s s l i c h   H  G,Ni c k l i n   M  J , e t   a 1 . A  s e g me n t   o ft h e   5’  
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1 9 8 8 , 6 2 ( 8 ) : 2 6 3 6— 4 3 .  
Co u l o mb e   P, Ro d i e r   G, Bo n n e i l   E, e t   a 1 .N? t e r mi n l  a u b i q u i t i n a t i o n   o f   e x t r a c e l l u l a r   s i g n l- a eg r ul a t e d   k i n a s e   3   a n d   p 21   d i r e c t s   t h e i r   d e g — -  

Yu   J, Zh a n g   L, Hwa n g   P   M, e t   a 1 .PUMA  i n d u c e s   t h e   r a p i d   a p o p —  

t e s i s   o f   c o l o r e e t a l   c a n c e r   c e l l s [ J ] .Mo l   C e l l , 2 0 0 1 , 7 ( 3 ): 6 7 3—  
8 2.  

r a d a t i o n   b y   t h e   p r o t e a s o m e [ J ].Mo l   C e l l   B i o l , 2 0 0 4, 2 4 ( 1 4) :  
6 】 4 0 —5 0.  

Na k a n o   K, Vo u s d e n   K   H. P UMA ,a   n o v e l   p r o a p o p t o t i c   g e n e,i s  

引 

Co n s t r u c t i o n   o f   e x p r e s s i o n   p l a s mi d   o f   t h e   mu t a n t   PUM A 
a nd   i t s   e x pr e s s i o n   i n   He l a   c e l l s  
Hu a n g   We i  , Wa n   F us h e n g   ,  

(   D e p t   o f   B i o c h e mi c a l   a n d   Mo l e c u l a r   B i o l o g y , ?。?e p t   f  o L a b o r a t o r y   A n i ma l  
S c i e n c e , N a n c h a n g   U n i v e r s i t y , N a n c h a n g ?。?3 0 0 0 6 )   Ab s t r a c t ?。?b j e c t i v e ?。?o   c o n s t r u c t   t h e   e u k a r y o t i c   e x p r e s s i o n   v e c t o r   o f   a   p r o - a p o p t o t i c   g e n e   P U MA( P 5 3 - u p r e g u l a t -  
e d   mo d i ie f r   o f   a p o p t o s i s ?。?n d   t h e   s i t e ? d i r e c t e d   mu t a g e n e s i s   v e c t o r   f o r   t h e   f ur t h e r   f u n c t i o n a l   s t ud y .M e t h o d s   PUMA 

w a s   a mp l i i f e d   b y   P C R   f r o m   p l a s m i d   o f   p C E P 4 - ( H A) 2 一 P U M A   a n d   s u b s e q u e n t l y   c l o n e d   i n t o   t h e   e u k a r y o t i c   v e c t o r  

p I R E S 2 - E G F P   t o   g e n e r a t e   p I R E S 2 一 E G F P - ( H A) 2 - P U MA .p I R E S 2 一 E G F P ? ( H A) 2 - P U MA - T 2 8 G   w a s   c o n s t uc r t e d  
t h r o ug h   s i t e — d i r e c t e d   mu t a g e n e s i s .S e q u e nc e   o f   t h e   i n s e te r d   g e n e   wa s   i de n t i ie f d   by   Pl a s mi d   PCR  a n d   a n a l y z e d   b y   s e q u e n c i n g   s ub s e q u e n t l y .He l a   c e l l s   we r e   d i v i de d   i nt o   4   g r o u ps : Wi l d   t y pe   P UMA  t r a n s f e c t i o n   g r o u p, mu t a n t   PUMA  t r a n s f e c t i o n   g r o u p, t he   e mp t y   v e c t o r   c o n t r o l   g r o u p, a n d   t h e   c o n t r o l   g r o u p. Ch a r a c t e is r t i c   mo r p h o l o g i c a l   c h a ng e s   o f   a p —   o p t o s i s   we r e   o b s e r v e d   b y   P I   s t a i n i n g. Th e   c e l l u l a r   a p o p t o s i s   r a t e s   we r e   e x a mi n e d   b y   FCM.Th e   e x p r e s s i o n   o f   PUMA  wa s   d e t e c t e d   b y   We s t e r n   b l o t   a n d   RT— PCR.Re s ul t s   DNA  s e q u e n c i n g   s h o we d   t ha t   TCC, whi c h   e n c o d e d   t h e¥ 1 0   o f  

P U MA, w a s   c h a n g e d   t o   G C C; t h e r e   w e r e   n o   mu t a t i o n   s i t e s   i n   o t h e r   c o d o n s   o f   P U M A   i n   p I R E S 2 一 E G F P ? ( HA) 2 - P U —  
MA- T 2 8G  r e c o mb i n a n t   p l a s mi d. Hi g h   e x p r e s s i o n   o f   EGFP   wa s   de t e c t e d   b y   lu f o r e s c e n c e   mi c r o s c o p e   a n d   P I   d y e i n g   d i s p l a y e d   t h a t   He La   c e l l s   h a d   a   s e r i e s   o f   a p o p t o s i s   mo r p ho l o g i c   c ha n g e s   a f t e r   t r a n s f e c t i n g   Wi l d   t y p e   a n d   mu t a n t   P U—  

MA  i n t o   He L a   c e l l s .T h e   r a t e   o f   a p o p t o s i s   b y   F C M  w a s   s i g n i i f c a n t l y   h i g h e r   i n   t h e   e x p e i r me n t a l   g r o u p   c o mp a r e d   wi t h  
t h e   e mpt y   v e c t o r   c o nt r o l   g r o u p   a n d   t h e   c o n t r o l   g r o u p. We s t e n  r b l o t   a n d   RT- P CR  d i s p l a y e d   t he   h i g h   e x pr e s s i o n   o f   PUMA  g e n e . Co n c l u s i o n   Th e   e u k a r y o t i c   e x p r e s s i o n   v e c t o r s   or f   PUMA  a n d   i t s   mu t a n t   c a n   b e   s u c c e s s f ul l y   c o n s t uc r —   t e d, wh i c h   ma y   pa v e   t h e   wa y   or f   f ur th e r   s t u d y   o n   t umo r   s u p p r e s s o r   f u nc t i o n   o f   P UMA  a n d   i t s   p o s t - t r a n s l a t i o na l   r e g u -  
l a t i o n   me c h a n i s m.  

Ke y   wo r d s   P 53 - up r e g u l a t e d   mo d i i f e r   o f   a p o p t o s i s;p I RES 2一 EGF P; s i t e — d i r e c t e d   mu t a g e n e s i s; uk a r y o t i c   e x p r e s s i o n  
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